| НОВЫЕ НОРМАТИВНЫЕ ДОКУМЕНТЫ | ||
|
Суд.Мед.Эксп., №4(1999) ©
П. Л. ИВАНОВ, 1999
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ИНДИВИДУАЛИЗИРУЮЩИХ СИСТЕМ НА ОСНОВЕ ПОЛИМОРФИЗМА
ДЛИНЫ АМПЛИФИЦИРОВАННЫХ ФРАГМЕНТОВ (ПДАФ) ДНК В
СУДЕБНО-МЕДИЦИНСКОЙ ЭКСПЕРТИЗЕ ИДЕНТИФИКАЦИИ ЛИЧНОСТИ И
УСТАНОВЛЕНИЯ РОДСТВА
(Утверждены Минздравом России 19.01.99) |
||
|
в) зона для анализа продуктов амплификации: оборудованные УФ-облучателями боксированные помещения с вытяжной вентиляцией — для проведения электрофореза ДНК. окрашивания гелей и документирования электрофореграмм.
Компартментализация рабочего процесса, связанного с применением ПЦР, служит абсолютно необходимой мерой предосторожности, которая позволяет свести к минимуму риск случайных загрязнений компонентов реакции ранее амплифицированными продуктами или молекулами ДНК из посторонних источников. Способность ПЦР амплифицировать единичные молекулы ДНК означает, что опасность представляют даже самые незначительные, следовые количества ДНК-контаминантов, которые могут вовлекаться в реакцию как матричные молекулы. Это приводит к искажению результатов исследования.
2.2. Необходимое оборудование.
В соответствии с процедурой метода на первом этапе осуществляются выделение из исследуемых объектов геномной ДНК, ее очистка, определение концентрации и хранение. Для этого необходимо типовое лабораторное оборудование для молекулярной биологии (в том числе вытяжной шкаф, мини- и микроцентрифуга, суховоздушный и водяной термостаты, рН-метр, аквадистиллятор-деионизатор, спектрофотометр, аналитические весы, микропипетки-дозаторы, лабораторная посуда, холодильник/морозильник).
Постановка ПЦР требует наличия стерильного шкафа-бокса с УФ-облучателем, а также термоциклера (ДНК-амплификатора). Эти позиции выпускаются серийно отечественными и зарубежными производителями. На этапе электрофоретического фракционирования ДНК необходимы стандартные аппараты для электрофореза в гелях агарозы и полиакриламида (соответственно горизонтальные и вертикальные), микроволновая печь, стандартные источники тока для электрофореза — низковольтный (300В/250мА) и высоковольтный (1000В/300мА), УФ-трансиллюминатор, снабженный системой документирования изображения (например, фото- или видеокамерой) и/или прибор для вакуумной сушки гелей. Для анализа результатов исследования и обработки экспертных данных требуется набор стандартной офисной оргтехники (компьютер с периферийными устройствами: принтер, сканер и пр.). 3. Технология использования метода.
Технологическая схема выполнения экспертизы вещественных доказательств с использованием ПДАФ-систем включает следующие этапы:
а) получение препаратов хромосомной ДНК из объектов исследования; б) энзиматичсская ПЦР-амплификация на матрице этой ДНК специфических участков, обладающих свойством ПДАФ с целью их последующего генотипирования (определения геномных вариантов): в) фрагментный анализ: фракционирование с помощью гель-электрофореза продуктов амплификации, сопоставление и сравнение амплификационных профилей, определение молекулярных размеров фрагментов и их генотипирование. г) интерпретация результатов: раздельная оценка выявленных геномных признаков и определение их индивидуализирующего значения, сопоставление и оценка различия и совпадения комплекса признаков, анализ всей совокупности экспертных данных с целью разрешения вопросов, поставленных перед экспертизой. 3.1. Получение препаратов ДНК.
Предметом судебно-медицинских молекулярно-генетических экспертных исследований являются следы и иные вещественные доказательства по делу — объекты биологического происхождения от трупов и живых лиц. Хромосомная ДНК содержится во всех ядерных клетках организма, поэтому для экспертного исследования в принципе пригодны любые биологические субстраты, в которых сохранились хотя бы единичные ядерные клетки или остатки их ядерного материала: мягкие ткани, жидкая кровь и выделения, высохшие следы крови и выделений, зубы и волосы человека, отчлененные части тела и фрагменты частей тела от неопознанных и расчлененных трупов, фрагменты скелетированных трупов, отдельные кости, костные фрагменты и др. При этом важно подчеркнуть, что во всех клетках одного организма ДНК одинакова. Это позволяет проводить отождествление объектов на основании сравнительного ПДАФ-анализа биологических образцов разного тканевого происхождения.
|
С точки зрения экспертного использования среди множества известных методик выделения и очистки ДНК наибольшее значение имеет классическая фенол-хлороформная экстракция, которая универсальна, обладает хорошей воспроизводимостью и способна обеспечить высокую степень чистоты ДНК: полученные этим методом препараты стабильны и могут храниться при 4'0С в течение нескольких лет. Поэтому методикам выделения ДНК, основанным на органической экстракции, следует отдать предпочтение.
В общем случае это многоэтапные процедуры, которые предусматривают разрушение (лизис) клеточных структур и диссоциацию хромосомных нуклеопротеидных комплексов с помощью применения детергентов, протеазную обработку лизата. экстрагирование белков органическими растворителями, отделение водной фазы, содержащей ДНК, и концентрирование и очистку ДНК путем спиртовой преципитации или ультрамикрофильтрации. Существуют также методики, которые без применения органических растворителей позволяют получать пригодные для анализа в ПЦР препараты ДНК. Большинство из них являются вариантами вышеприведенной схемы, но позволяют экономить время и не прибегать к трудоемкой процедуре фснольной экстракции. Однако эти процедуры применимы лишь для некоторых видов объектов. Наиболее распространенным универсальным неорганическим методом, пригодным для экспертного применения, является метод с использованием хелатирующего реагента "Килекс" (Chelex® 100). Это экспресс-метод, который вообще не предполагает выделения ДНК в очищенном виде; получаемый препарат по сути представляет собой клеточный лизат, который содержит все исходные компоненты, только и инактивированной форме. Этот метод прост и не требует много времени. Нужно, однако, учитывать, что его надежность, а также качество и стабильность "килексных" препаратов в целом заметно ниже, чем фенол-хлороформных экстрактов. Очень важный в экспертной практике частный случай — получение ДНК из спермы и смешанных следов, содержащих сперму. Особенность в том, что хроматин сперматозоидов имеет принципиальное отличие от хроматина соматических клеток — его структура дополнительно стабилизирована дисульфидными связями. Поэтому применяемый по стандартной процедуре выделения ДНК протеолиз в случае спермального хроматина малоэффективен и идет очень медленно, а используемые для диссоциации нуклеопротеинов детергенты практически не оказывают на него солюбилизирующего действия. В результате выход спермальной ДНК оказывается практически нулевым. Для преодоления этой трудности при выделении ДНК из спермы и клеточный лизат вводят дополнительно реагенты-тиовосстанонитс-ли, например дитиотрейтол или 2-меркалтоэтанол, которые разрушают дисульфидные белковые сшивки. Это позволяет продолжить процесс по стандартной схеме. На использовании описанной особенности спермального хроматина основан общепринятый метод селективного выделения ДНК сперматозоидов из смешанных следов, содержащих сперму. Это двухэтапная процедура, получившая название дифференциального лизиса клеток. Суть се заключается в том, что при выделении ДНК из смеси сперматозоидов и соматических клеток на первом этапе, представляющем собой стандартный протеазно-детергентный лизис, солюбилизируется только хроматин соматических клеток. Его раствор отделяют центрифугированием от остающегося структурированным (и потому нерастворимым) спермального хроматина и используют для экстрагирования соматической ДНК. Отделенный же спермальный хроматин подвергают второму литическому циклу, но уже с добавлением реагентов-тиовосстановителей, и уже потом из получившегося лизата экстрагируют спермальную ДНК. Следует особо подчеркнуть, что при проведении судебно-медицинского исследования следов, содержащих сперму, для дифференцирования присутствующих в смеси генетического материала мужчины-донора спермы и ДНК из других возможных источников (например, эпителиальных клеток и клеток крови потерпевших при изнасиловании), в обязательном порядке должны применяться только такие методики, которые включают двухэтажный дифференциальный лизис клеток с использованием на втором этапе реагентов-тиовосстановителей. Типовые варианты методик получения препаратов ДНК из объектов экспертизы — как с использованием органической экстракции, так и в виде "килексных" лизатов — приведены и сборнике "Стандартные операционные процедуры" (РЦСМЭ Минздрава РФ, 1999). 3.2. ПЦР-амплификация полиморфных локусов на матрице геномной ДНК. При постановке ПЦР геномную ДНК, обычно в количестве 2—200 нг, вводят в реакционную смесь, содержащую все необ- |
|
|
|
| <<< юридический раздел PATERNITY.RU | Страницы "Медодич. указаний..." 1 2 3 4 5 6 7 |