| НОВЫЕ НОРМАТИВНЫЕ ДОКУМЕНТЫ | ||
|
Суд.Мед.Эксп., №4(1999) © П.
Л. ИВАНОВ, 1999
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ
ИНДИВИДУАЛИЗИРУЮЩИХ СИСТЕМ НА ОСНОВЕ
ПОЛИМОРФИЗМА ДЛИНЫ АМПЛИФИЦИРОВАННЫХ
ФРАГМЕНТОВ (ПДАФ) ДНК В СУДЕБНО-МЕДИЦИНСКОЙ
ЭКСПЕРТИЗЕ ИДЕНТИФИКАЦИИ ЛИЧНОСТИ И
УСТАНОВЛЕНИЯ РОДСТВА
(Утверждены Минздравом России 19.01.99) |
||
|
ходимые компоненты для работы фермента — термостабильной ДНК-полимеразы (обычно, Taq-полимеразы в количестве 1 — 3 е. а.) Там хромосомная ДНК будет служить субстратом—матрицей для амплификации нужного локуса. Специфическим компонентом реакции и амплификационной индивидуализирующей системы в целом являются олигонуклеотидные (15—30 звеньев) праймеры — именно они определяют, какой генетический локус будет избирательно нарабатываться в ходе реакции. Праймеры ориентированы таким образом, что синтез новых полинуклеотидных цепей с помощью ДНК-полимеразы осуществляется только между ними, удваивая в каждом цикле количество копий этого участка ДНК. Для проведения полимеразной цепной реакции, кроме исходного препарата ДНК, праймеров (в концентрации 0,1 — 1 мкмоль/л), Taq-полимсразы, нужны еше так называемые предшественники ДНК — дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (дезоксинуклеотиды) в концентрации 200 мкмоль/л и солевой буферный раствор. Эти компоненты смешивают в реакционной пробирке в микрообъёме (обычно 25—100 мкл) и помещают в специальный прибор — программируемый термоциклер (ДНК-амплификатор), который обеспечивает необходимый температурный профиль реакции: она претерпевает 25—35 циклов нагрева и охлаждения в интервале температур от 50 до 95*С.
Параметры температурного профиля — продолжительность и температура каждой стадии полимеразной реакции зависит от структуры используемых праймеров и потому индивидуальны для каждой конкретной амплификационной индивидуализирующей системы. Весь процесс длится несколько часов. За время процесса интересующие последовательности ДНК, присутствующие в исходной геномной матрице, многократно (миллионократно) копируются ферментом Taq-полимеразой, и эти молекулярные копии накашиваются в реакционной смеси. Амплифицируемые в ходе ПЦР мини- и микросателлитные участки (локусы) ДНК — относительно короткие нуклеотидные последовательности, организованные в виде блоков тандемных повторов. Высокий уровень вариабельности (феномен гиперполиморфизма) микро- и минисателлитов основан на том, что число тандемных повторов, соединенных "голова к хвосту" в единую последовательность ДНК непостоянно и варьирует в разных аллелях данного локуса от одного до нескольких десятков. Таким образом, для данного локуса в популяции обнаруживается целый набор аллелей (феномен мультиаллельности), отличающихся друг от друга числом повторяющихся единиц. У каждого индивидуума в популяции из этого набора имеется по 2 аллеля равной или разной длины (соответственно гомо- и гетерозиготное состояние). Такого рода генетические элементы получили название локусов с варьирующим числом тандемных повторов или просто тандемных повторов с переменным числом звеньев. В методическом плане важно отметить, что класс тандемных полиморфных локусов условно разбит на два подкласса: мини-сателлитов или VNTR (англ. — Variable Number Tandem Repeat) — с длиной повтора более семи пар нуклеотидов. и микросателлитов, у которых длина повторяющейся единицы составляет от одного до семи пар нуклеотидов и которые еще называют короткими тандемными повторами или STR (англ. — short tandem repeat). Эти две группы ПДАФ-систем хотя и являются функциональными аналогами, не вполне эквивалентны по своим прикладным свойствам; в аспекте судебно-медицинской экспертизы их следует рассматривать как взаимнодополняюшие. Суть их особенностей в следующем. Большинство минисателлитных систем обладают гораздо более высоким полиморфизмом, чем микросателлитные. Соответственно их дифференцирующие свойства также заметно выше. Однако существенные ограничения накладываются на ПДАФ-анализ минисателлитных локусов при исследовании деградированных препаратов ДНК, например выделенных из пятен крови, спермы, слюны, а также частей волосяного покрова и трупного материала, подвергшихся разложению под действием разрушающих биологических или физико-химических факторов. При анализе подобных препаратов может наблюдаться отсутствие электрофоретических полос в аллельном диапазоне, что. как правило, свидетельствует о деградации аллелей анализируемого локуса. Если же при анализе деградированного образца ДНК обнаруживается только один низкомолекулярный аллель, то в этом случае существует опасности ложной гомозиготности: возможно, анализируемый образец является гетерозиготным, но высокомолекулярный аллель не выявляется в ходе исследования, поскольку степень его деградации оказывается более высокой. С этой точки зрения ПДАФ-типирование микросателлит-ных STR-локусов может дать определенные преимущества. Так. благодаря более коротким по сравнению с минисателлит-ными размерам STR-аллелей в целом выше вероятность их со- |
хранения в декодированной ДНК. На практике это означает ощутимый выигрыш в чувствительности анализа. Кроме того, вероятность ложной гомозиготности, обусловленной предпочтительной амплификацией низкомолекулярных аллелей, очень низкая для микросателлитных локусов вследствие узости спектра аллельных длин.
В настоящее время для экспертных целей разработано несколько десятков молекулярно-генетических ПДАФ-систем на основе мини- и микросателлитных полиморфных локусов. Следует иметь в виду, что в случае микросателлитов, согласно международной практике, для экспертного применения подходят только "крупные" — тетра- и пентануклеотидные STR.
3.3. Фрагментный анализ. Позиционное сопоставление
Гипервариабельные тандемно организованные локусы содержат различное число повторяющихся элементарных звеньев-повторов. При амплификации с праймерами, расположенными на флангах такого локуса, образуются фрагменты ДНК различной длины, причем длина фрагмента будет пропорциональна числу повторов. Таким образом, в данной аналитической системе любой индивидуальный образец ДНК человека характеризуется наличием двух амплифицированных фрагментов разной или одинаковой длины (соответственно гетеро- и гомозиготное состояние), поскольку каждая из двух гомологичных хромосом несет свой вариант гипервариабельного локуса, и эти варианты могут отличаться числом содержащихся в них тандемных повторов.
Синтезированные в ходе ПЦР продукты — молекулярные копии полиморфных участков геномной ДНК — накапливаются в реакционной смеси, вследствие чего количественно оказываются доступными для сравнительного анализа. Для этого полученные амплификационные продукты фракционируют по длине с помощью электрофореза в геле агарозы или полиакриламида (в последнем случае применяют как обычный электрофорез, так и электрофорез в денатурирующих условиях) и фрагменты ДНК, амплифицированные в ходе реакции, выявляют различными методами детекции. Чаще всего на электрофореграмме визуализируют полосы (зоны локализации фрагментов ДНК одного размера) с помощью флюоресцентного красителя этидиумбромида и затем регистрируют фотографически в УФ-свете или путем окрашивания нитратом серебра (в акриламидных гелях) с последующей фиксацией и высушиванием геля
Индивидуальность ДНК реализуется в виде индивидуально-специфичной комбинации из двух полиморфных фрагментов (полос на электрофореграмме), характеризующихся определенным расположением на дорожке геля. Это так называемый амплификационный профиль ДНК, который и является в данном случае индивидуализируюшей геномной характеристикой человека, которому принадлежит анализируемая ДНК. С целью отождествления амплификационных профилей ДНК или выявления в них признаков сходства и различий проводят их позиционное сопоставление.
При анализе электрофореграммы можно выделить два аспекта: а) картины распределения полос на сравниваемых дорожках геля похожи или непохожи; б) позиции соответствующих фрагментов совпадают или не совпадают.
Вопрос о том. одинаковы или неодинаковы эмплификационные профили, полученные при анализе препаратов ДНК, выделенных из объектов экспертизы (скажем, из биологических следов на вещественных доказательствах л из крови проходящих по делу лиц), является в экспертизе" ключевым. Это ясно, поскольку от того, как будет интерпретирован результат сравнения, зависит экспертный вывод: в одном случае это не исключение, а в другом — исключение причастности данного лица к происхождению следов. Между тем именно вопрос о похожести и непохожести геномных профилей таит в себе большую опасность неверного решения из-за множества имеющихся здесь подводных камней. Некоторые из них мы и рассмотрим в этом разделе.
3.3.1. Ложное генотипирование.
Что касается общей похожести одного геномного профиля на другой, то здесь ложный результат может быть обусловлен двумя причинами. Во-первых, присутствие в сравниваемых препаратах ДНК постороннего генетического материала (чаще всего в результате случайных загрязнений) может имитировать как совпадение, так и различие их геномных профилей. Во-вторых, этот же эффект может проявиться как результат неправильного генотипирования, в частности ложноопределенной гомо- или гетерозиготности анализируемых объектов. Это связано с артефактами полимеразной цепной реакции, возникающими под влиянием неоптимальных условий ее проведения:
|
|
|
|
| <<< юридический раздел PATERNITY.RU | Страницы "Медодич. указаний..." 1 2 3 4 5 6 7 |