| НОВЫЕ НОРМАТИВНЫЕ ДОКУМЕНТЫ | ||
|
Суд.Мед.Эксп., №4(1999) © П.
Л. ИВАНОВ, 1999
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ
ИНДИВИДУАЛИЗИРУЮЩИХ СИСТЕМ НА ОСНОВЕ
ПОЛИМОРФИЗМА ДЛИНЫ АМПЛИФИЦИРОВАННЫХ
ФРАГМЕНТОВ (ПДАФ) ДНК В СУДЕБНО-МЕДИЦИНСКОЙ
ЭКСПЕРТИЗЕ ИДЕНТИФИКАЦИИ ЛИЧНОСТИ И
УСТАНОВЛЕНИЯ РОДСТВА
(Утверждены Минздравом России 19.01.99) |
||
|
— избыточным или недостаточным исходным количеством матричной ДНК;
— плохим качеством препарата; — неспецифичностью праймеров и/или неадекватно подобранным для них рабочим режимом, например отжигом при более низкой, чем следует, температуре; — неоптимальной концентрацией Taq-полимеразы в реакционной смеси, в частности ее избыточным количеством: — присутствием в реакции неоптимальной концентрации ионов Mg2+; — профилем кривой нагрева реакционной смеси с неоптимальными значениями температурных переходов (это может быть вызвано неудачными техническими параметрами прибора, используемого для амплификации ДНК); — неоптимальной продолжительностью процесса циклического наращивания.
Наиболее распространенный артефакт — так называемый феномен предпочтительной амплификации аллелей — довольно часто приводит к ошибочному заключению о гомозиготности. Вместе с тем наряду с опасностью типирования ложных гомозигот нередки и более сложные случаи искажения генотипа, характеризующиеся не только частичной утратой истинных аллелей, но и амплификацией неспецифических (неаллельных) фрагментов, имитирующих ложногетерозиготный аллельный профиль. Решить проблему ложноопределенной гомо- или гетерознготности о некоторых случаях бывает весьма непросто. Помочь здесь может анализ устойчивости амплификационных профилей, основанный на амплификационном титровании сомнительных препаратов, использовании разных условий электрофореза и сред разделения, а также многократная проверка воспроизводимости результата.
3.3.2. Сдвиг полос.
Второй аспект вопроса — физическое сопоставление полос на электрофореграмме — также требует учета многих факторов. Одна из неприятностей здесь так называемый сдвиг полос, когда в процессе электрофореза фрагменты ДНК в одной дорожке геля движутся быстрее или медленнее, чем идентичные фрагменты в соседней дорожке. Это явление имеет несколько причин:
— неодинаковое количество ДНК в разных дорожках геля: — неодинаковые ионные условия в препаратах, внесенных в разные дорожки геля (присутствие в препаратах примесей, влияющих электрофоретическую подвижность ДНК — солей, спирта, фенола, этидиумбромида и др.); — избыточная напряженность электрического поля; — перегрев и нарушение структуры геля (избыточный ток): — истощение электрофорезного буфера; — микрогетерогенность геля (в частности, недостаточно высокое качество среды разделения). Большая часть перечисленных факторов поддается контролю, поэтому решением проблемы могут быть оптимизация и текущий мониторинг соответствующих параметров. В некоторых случаях сдвиг полос носит не ступенчатый, а сглаженный характер (например, хорошо известный эффект "улыбки"). Тогда возникающие геометрические искажения электрофоретической картины в принципе поддаются математическому анализу и могут быть скомпенсированы на стадии обработки изображения. Для этого рекомендуется кроме фланкирующих дорожек также и каждую третью-четвертую дорожку геля делать референтный, т. е. вносить в нее маркеры молекулярных масс, по которым будет рассчитываться фактор коррекции. Следует, однако, сказать, что надежная математическая коррекции возможна не всегда и электрофорез по возможности следует повторить. 3.3.3. Разрешающая способность электрофореза.
Еше один очень важный момент, о котором следует помнить при позиционном сопоставлении полос на электрофореграмме, это разрешающая способность используемой электрофоретичеcкой системы. Оценка этого параметра имеет принципиальное значение для решения вопроса о самой возможности адекватного сравнения амплификационных профилей. Для того чтобы иметь такую возможность, необходимо быть уверенным, что применяемая для фракционирования амплифицированных фрагментов ДНК аналитическая система позволяет уверенно различать аллельные варианты, отличающиеся длиной как минимум на одно повторяющее звено. Иначе, можно ошибочно посчитать идентичными те фрагменты, которые имеют близкую, но не одинаковую длину.
Для разделения аллелей применяемых на практике локусов с варьируюшим числом тандемных повторов, таких как STR-локусов (длина повторяющейся последовательности 2—4 п. н.) и VNTR-локусов с коротким шагом (в частности, минисателлит-
|
ного локуса D1S80, где длина повторяющейся последовательности составляет 16 п. н.), необходимо иметь возможность различать фрагменты ДНК, которые отличаются длиной на 1—2% (и даже меньше в случае коротких тандемных повторов). Это справедливо и в случае электрофоретического фракционирования половых гетероформ амелогенинового гена, где надежность разделения дублета XY (106/112 п. н.) имеет принципиальное значение для использования данного теста.
Обеспечить такое разрешение способна не всякая электро-форстическая система. В первую очередь это обусловлено высокими требованиями, предъявляемыми к электрофоретическим средам разделения. В современном анализе ДНК применяются агарозные и полиакриламидные гели. Если говорить об агарозных гелях, то они, безусловно, являются наиболее удобными и технологичными системами для электрофоретического анализа ДНК: с ними легко манипулировать и они не оказывают присущее акриламиду нейротоксическое действие. Кроме того, стандартные нативные гели агарозы в гораздо меньшей степени, чем полиакриламидные среды, чувствительны к случайным флуктуациям в макроструктуре молекул ДНК, и поэтому менее склонны к определенным, связанным с этим артефактам, которые могут приводить к позиционным искажениям в анализируемом геномном профиле и как следствие к ошибкам при идентификации аллелей. Однако следует помнить, что разделяющая способность обычных агарозных гелей в отношении фрагментов ДНК малого размера намного ниже, чем у полиакриламидных, и поэтому они непригодны для фрагментного анализа STR-локусов и даже некоторых VNTR-локусов с коротким шагом. В этих случаях следует использовать специальные агарозные среды, такие как модифицированные агарозы семейства NuSieve® и MеtaPhor® фирмы "FMC Bio Products" (США) или аналогичные им продукты других фирм. Акриламидные гели могут применяться как нативные, так и денатурирующие. Каждая из этих систем имеет ряд особенностей. Из принципиальных моментов отметим, что интерпретация электрофореграмм, полученных в денатурирующих условиях, может осложняться эффектом "разделения цепей", когда индивидуальные фрагменты ДНК в геле оказываются представленными двумя полосами. Что касается нативных полиакриламидных гелей, то в целом это системы с нехарактерными для агарозы электрофоретическими свойствами: они более чувствительны к пространственно-конформационным параметрам молекул ДНК. Поэтому в этих гелях электрофоретическое поведение фрагментов ДНК довольно сильно зависит от их нуклеотидного состава, что может проявляться в так называемом эффекте аномальной электрофоретической подвижности и вызывать определенные геометрические искажения амплификационного профиля, в частности позиционные несоответствия, касающиеся наблюдаемых и реальных размеров фрагментов. На практике разрешение электрофореза нужно обязательно контролировать, например визуально, используя наборы локус-специфичных аллельных маркеров (аллельных "лестниц"), или с помощью компьютерных программных средств с применением внутренних или внешних маркеров молекулярных масс 3.3.4. Измерение электрофоретической подвижности фрагментов ДНК.
Из сказанного выше очевидно, что вопрос позиционного совпадения или несовпадения амплифицированных фрагментов ДНК и сравниваемых геномных профилях (по сути вопрос их тождественности или отличия) не может быть адекватно решен на глазок. И прежде всего потому, что при таком способе оценки трудно учесть все действующие факторы в их совокупности, а именно это влияет на результат. Так, например, при невысоком электрофоретическом разрешении можно ошибочно отождествить заведомо разные фрагменты, поскольку их позиции совпадут на электрофореграмме. В более сложных случаях, и сочетании с выраженным эффектом сдвига полос, недостаточное разрешение электрофореза может принести к тому, что наоборот заведомо одинаковые фрагменты будут иметь разные позиции на геле и восприниматься как разные аллели.
Поэтому, строго говоря, вопрос позиционного совпадения или несовпадения фрагментов ДНК должен решаться аналитическим путем — на том основании, что позиции сравниваемых фрагментов попадают или же не попадают в интервалы, удовлетворяющие установленным допускам. Очевидно, что такой подход и первую очередь требует выполнения физических измерений на электрофореграмме и учета их неизбежных неточностей. Существует множество методов, позволяющих проводить измерение электрофоретической подвижности фрагментов ДНК на геле. При этом определенные ограничения па применимость того или иного метода накладывают погрешности измерений.
|
|
|
|
| <<< юридический раздел PATERNITY.RU | Страницы "Медодич. указаний..." 1 2 3 4 5 6 7 |