| НОВЫЕ НОРМАТИВНЫЕ ДОКУМЕНТЫ | ||
|
Суд.Мед.Эксп., №4(1999) © П.
Л. ИВАНОВ, 1999
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ
ИНДИВИДУАЛИЗИРУЮЩИХ СИСТЕМ НА ОСНОВЕ
ПОЛИМОРФИЗМА ДЛИНЫ АМПЛИФИЦИРОВАННЫХ
ФРАГМЕНТОВ (ПДАФ) ДНК В СУДЕБНО-МЕДИЦИНСКОЙ
ЭКСПЕРТИЗЕ ИДЕНТИФИКАЦИИ ЛИЧНОСТИ И
УСТАНОВЛЕНИЯ РОДСТВА
(Утверждены Минздравом России 19.01.99) |
||
|
Так, наиболее простой, но и наименее точный способ — измерение обычной линейкой. Однако он оказывается неприемлемым относительно коротких агарозных гелей, когда цена деления мерной шкалы легко "вмещает" разницу в подвижности двух соседних аллелей. Более или менее универсальный вариант — это так называемый дигитайзер (анг. — digitizer), представляющий собой электронный модуль, включающий курсор-измеритель и цифровое координатное устройство. Такой модуль может использоваться как самостоятельный прибор или в качестве составной части компьютерных систем обработки изображения. Наивысшую надежность и точность измерений обеспечивают компьютеризованные регистрирующие системы, снабженные соответствующими программными средствами.
В качестве примера можно привести компьютеризованную систему TVID-DATAPHOR, разработанную и внедренную в 1992—1993 гг. в Бюро главной судебно-медицинской экспертизы Минздрава РФ. При помощи видеокамеры данная система позволяет получать и хранить в памяти компьютера оцифрованное изображение окрашенного геля. Программные средства позволяют эксперту осуществить контроль электрофоретического разрешения, провести анализ распределения материала в полосе на электрофореграмме и двухмерное измерение пробега в геле, а затем определить размеры фрагментов ДНК с использованием нескольких алгоритмов. Предусмотрена также возможность коррекции электрофоретической неоднородности геля. Программа—дигитайзер имеет координатную систему с ценой деления в 1 пиксел, что обеспечивает точность измерений в реальном масштабе в пределах +/— 0,1 мм.
3.3.5. Позиционные критерии сопоставления геномных
В плане решения ключевого вопроса — позиционного совпадения или несовладения фрагментов ДНК — оценка величины физической погрешности, используемой экспертом аналитической системы, позволяет установить для данной системы соответствующие объективные правила позиционного сопоставления амплификационных профилей.
Рассуждая чисто теоретически, обобщенные требования для аналитической системы просты, а именно: позиции на геле разных аллельных фрагментов не должны совпадать, а одинаковых — различаться. Однако не следует забывать, что физическая погрешность используемых на практике аналитических систем — реальная величина, и поэтому позиции идентичных фрагментов на геле могут несколько различаться. Это может привести к неоднозначному истолкованию результата. Чтобы избежать интерпретационных ошибок, надо руководствоваться следующими критериями оценки: — два фрагмента ДНК считать тождественным и друг другу, если их позиции на геле не отличаются более чем на удвоенную величину физической погрешности системы при условии, что разрешение электрофореза в этой точке достаточно, чтобы величина физической погрешности была меньше 1/4 длины ал-лсльного шага на минимально измеряемую величину: — два фрагмента ДНК нетождественны, если при том же условии их позиции на геле отличаются более чем на удвоенную величину физической погрешности. 3.3.6. Определение размера и генотипирование фрагментов.
Для индивидуализирующих ПДАФ-систем, которые основаны на использовании полиморфных локусов с дискретным распределением аллелей, применение локусспецифичных аллельных маркеров (аллельных "лестниц") позволяет относительно просто осуществлять генотипирование аллельных профилей и при условии, что в каждом эксперименте были соблюдены необходимые позиционные критерии сопоставления полос (см. выше), переходить от позиционного анализа в рамках одного эксперимента к безотносительному сравнению генотипов объектов.
В том числе, если используются другие (неаллельные) маркеры молекулярных масс, ключом к генотипированию, т.е. к идентификации аллелей, служит молекулярный размер (длина) амплифицированных фрагментов, определяемый расчетным путем на основании физических измерений пробега фрагментов ДНК на электрофорсграмме. Однако здесь существуют важные дополнительные условия, без учета которых определение размеров амплифицированных фрагментов ДНК не всегда может гарантированно обеспечить правильную идентификацию аллелей, которым эти фрагменты соответствуют. Чтобы определить размеры амплифицированных фрагментов ДНК по их расположению на геле, в первую очередь нужно проанализировать профиль электрофоретического разделения для данного конкретного геля и для него определить точный характер зависимости электрофоретической подвижности фрагментов от их размеров. Это можно сделать, используя стандарты |
молекулярных масс, т. е. фрагменты ДНК заранее известного размера, которые фракционируют на том же геле, что и анализируемые амплифицированные фрагменты.
По характеру применения электрофоретические стандарты молекулярных масс бывают внешними и внутренними. Внешние стандарты наносят на гель так, что они образуют самостоятельные — контрольные или маркерные — дорожки. Чтобы минимизировать возможные пространственные искажения — как реальные, так и кажущиеся (параллаксные), которые влияют на точность сопоставления характеристик стандартной и анализируемой дорожек, маркерные дорожки следует располагать на геле как можно ближе к дорожкам, где движутся анализируемые фрагменты ДНК. Такой проблемы не возникает в том случае, если стандарты молекулярных масс вносят непосредственно в ту же дорожку, где фракционируют интересующие амплифицированные фрагменты (внутренний стандарт). Однако в обычной практике использование внутренних стандартов пригодно лишь для решения ограниченного круга задач: универсализация же этого подхода требует специальной приборной базы (например, многоцветной флюоресцентной детекции). Анализ данных электроакустического разделения стандартных (маркерных) фрагментов позволяет определить параметры кривой зависимости электрофоретической подвижности фрагментов от их размеров для данного конкретного геля и затем, используя эти параметры, рассчитать длину анализируемого фрагмента на основании величины его электрофоретической подвижности. Для этого существуют специальные расчетные алгоритмы, которые характеризуются разной степенью точности. Это надо учитывать. Кроме того, еще один важный момент заключается в следующем: принципиальное значение для всех алгоритмов имеет условие, что стандарты (маркерные фрагменты) и анализируемые фрагменты гомологичны, т. е. представлены одинаковыми полинуклеотидными последовательностями. Если это условие не соблюдено, т.е. нуклеотидный состав и первичная структура анализируемой и контрольной ДНК различны, то ошибка в определении размера фрагментов может достигать нескольких процентов. (Это связано с минорными различиями в физико-химических и как следствие в электрофоретических свойствах полинуклеотидных цепей с различным нуклеотидным составом.) Таким образом, погрешность расчетов при определении размера фрагментов является важной составляющей (вместе с физической погрешностью), которую необходимо учитывать при оценке обшей ошибки генотипирования, присущей данной аналитической системе в целом. Все это означает, что генотипические характеристики, полученные расчетным путем на основании величины электрофоретической подвижности гетерологичных стандартов молекулярных масс являются условными и поэтому не могут быть напрямую использованы для сопоставления как элементы банка данных, например для сопоставлении геномных профилей, полученных на разных гелях. Чтобы получить такую возможность, необходимо как минимум использовать одинаковые маркеры или провести нормирование ошибки и осуществить коррекцию всех данных по эталону, например по гомологичному аллельному маркеру. Последний вариант предпочтителен, поскольку позволяет оперировать не условными, а истинными генотипами, что необходимо для корректной статистической обработки данных.
3.4. Интерпретация результатов генотипирования.
Достоверная нетождественность аллельных профилей ДНК трактуется в общем случае как исключение происхождения сравниваемых биологических объектов от одного индивидуума. При этом следует соблюдать следующее условие: несовпадение аллельных профилей в исследуемых препаратах ДНК имеет доказательственное исключающее значение только при том условии, что оно зарегистрировано более чем в одной ПДАФ-сис-тсме и соответствующие полиморфные локусы генетически не сцеплены. (Это требование компенсирует возможность соматических и гаметических мутаций в исследуемых локусах хромосомной ДНК.)
В свою очередь достоверная тождественность аллельных профилей ДНК не влечет безусловный вывод о происхождении сравниваемых биологических объектов от одного индивидуума. Здесь строго обязательна вероятностная оценка генетической идентичности объектов экспертизы при условии зарегистрированного совпадения их ПДАФ-профилей. Это требование диктуется необходимостью принимать во внимание возможность случайного совпадения индивидуализирующих признаков разных лиц. Действительно, совпадение амплификационных профилей (генотипов) в препаратах ДНК, полученных из биологических следов с места преступления и » ДНК подозреваемого, еще не означает, что у этих двух ДНК общее происхождение. Иначе говоря, сам по себе факт генотипического совпадения не обяза- |
|
|
|
| <<< юридический раздел PATERNITY.RU | Страницы "Медодич. указаний..." 1 2 3 4 5 6 7 |